Biomacromoleculaire interacties van polyadhesinen bij de fimbriële biogenese aan het buitenmembraam van Escherichia coli, in biofilms en met hun eukaryote receptoren.

Inleiding Adhesie is een eerste en kritische stap in de kolonizatie van zoogdierepithelium door commensale en pathogene bacteriën. Bacteriën maken hiervoor op hun celoppervlak lange, harige polymere organellen aan, bestaande uit een aanéénschakeling van proteïnesubeenheden met een immunoglobuline(Ig)-vouwing. Deze pili of fimbriae zijn primaire aanhechtingswerktuigen van de bacteriën die ook aanleiding kunnen geven tot bacteriële invasie, afhankelijk van de receptoren herkend op het geïnfecteerde weefsel [1]. Fimbriae spelen ook een belangrijke rol in homotypische interacties zoals in biofilms, zowel buiten [2] als binnenin de geïnfecteerde cellen [3], en vormen aldus een belangrijk onderdeel van de pathogene cyclus die de bacteriën doorlopen. Er bestaat een grote verscheidenheid in het voorkomen van fimbriae en pili, alsook in de aard van de receptoren die ze herkennen. Type 1 en P pili zijn rigide staafjes van ongeveer 1 ?m lang die gevormd worden door een rechtsdraaiende helix met zo'n 3.2 Ig-subeenheden per draai. Op het fibrillair uiteinde van deze pili bevindt zich een bacterieel adhesine dat specifieke glycoproteïnen en/of -lipiden herkent. Deze tip adhesinen hebben twee domeinen (two-domain adhesin, TDA), een suikerbindend- en een pilinedomein. Daarnaast hebben pili en fimbriae een affiniteit voor componenten van de extracellulaire matrix (ECM, bvb collageen) of lumen (bvb Tamm-Horsfall glycoproteïne, THP, in urine) op een manier die meer dan alleen het adhesine aan de tip omhelst. Fimbriae zijn flexibeler en verschillende ?ms-lang en blijken beter geschikt om aan te hechten aan onregelmatige celoppervlakken zoals microvilli in de darm. Sommige fimbriae zijn zo fijn dat ze oorspronkelijk waargenomen werden als kapsules (bvb. K88, de oude benaming voor F4) of sheets (het F1 antigen van Yersinia pestis). Bacteriële adhesie van enterotoxigene Escherichia coli (ETEC) stammen door fimbriae (bvb F4, F5, F6, F17, F18 en F41) veroorzaakt diarrhea in pasgeboren kalfjes, lammetjes en geitjes (F17) of pasgespeende varkentjes (F4), terwijl bvb de relatie tussen F18 fimbriae en het Shiga-toxine Stx2e tot de gevaarlijke slingerziekte bij varkens kan leiden. F4 en F5 fimbriae zijn polyadhesinen, wat wil zeggen dat het hoofdpiline (= SDA, single domain adhesin) de adhesieve eigenshap draagt. De kristalstructuur van het F4 polyadhesine toont een lineaire suikerbindingssite die zich als een gordel rond de molecule slingert [4]. Dit komt goed overeen met de voorkeur voor de Glc(?1-4 of - 6)Glc disaccharide-eenheden van natuurlijke polysacchariden, zoals bepaald op een glycaan microarray. In de biogenese van pili en fimbriae in Gram-negative bacteriën is enerzijds genexpressie sterk gereguleerd, anderzijds zijn er helperproteïnen onder de vorm van periplasmatische chaperons en een buitenmembraan portier, genaamd usher, voorzien binnen het pilus operon. De grote gemeenschappelijke factor van pili en fimbriae is het missen van de 7de, C-terminale ?-streng in de Ig-vouwing van hun structurele eiwitten, de pilinen. De sterische chaperon voorkomt dat het piline misvouwt ten gevolge van het gebrek aan de C-terminale ?-streng. Het stabiliseert het piline door het verlenen van een donorstreng en presenteert het piline assemblage-competent aan de usher, klaar voor donorstrenguitwisseling van de chaperon donorstreng met de N-terminale donorstreng van het piline afkomstig van een volgend inkomend chaperon-piline complex aan de usher. De finale, vervolledigde Ig-vouwing van de pilinen bepaalt meteen ook de stabiliteit van de fimbriae. Pili worden verder gestabilizeerd door quaternaire interacties tussen de subeenheden. Een recombinant, donorstreng-gecomplementeerd piline kan wel op zichzelf vouwen, zonder de hulp van een chaperon [5]. Recente tot heet-van-de-naald structuren van celadhesieproteïnen, die stabiele interacties of signaaltransductie bemiddelen tussen zoogdiercellen, laten ons verbazingwekkende gelijkenissen zien met fimbriae, zoals het belang voor adhesie van het aantal Ig-modules en inter-Ig-domein interacties in deze fibrillaire structuren [6-8]. Het belang van het aantal Ig-modules in cel-cel contacten wordt stilaan ook duidelijker met kristalstructuren zoals deze van het receptorproteïne tyrosine phosphatase ? (RPTP?). RPTP? ageert als een spacer-clamp in celadhesie met een afstand tussen de cellen die bepaald wordt door het aantal Ig-modulen in zijn ectodomein [6]. Zo ook wordt de lengte van fimbriae gecontroleerd door minor pilinen, zoals FedE en FedF voor F18 [9], maar de relatie van fimbriële lengte met celadhesie is niet bestudeerd. De defosfatase activiteit van het cytoplasmatische gedeelte van RPTP? stabilizeert de celadhesie, in tegenstelling tot fosforylatie dat typisch celsignalizatie triggert. Bacteriën maken handig gebruik van gastheercelreceptoren die betrokken zijn in signalizatie en celadhesie. Recent werd ontdekt dat het FimH 2 - 2 - tipadhesine op een glycaan-afhankelijke manier aan ?3?1 integrinen bindt, wat invasie van blaascellen door uropathogene E. coli vergemakkelijkt [1]. ?3?1 integrinen komen universeel op het blaasepithelium voor. Integrinen zijn heterodimere, integrale membraanproteïnen die de ECM linken aan het cytoskeleton via een transmembranaire helix. Ze interageren met intercellulaire celadhesiemoleculen (ICAMs), fibronectine of laminine, die een geconserveerd glutamaat dragen voor de interactie met het ? metaalion afhankelijk domain (MIDAS), alsook een RGD motief (ArgGlyAsp) voor de interactie met het ? MIDAS domein. Voor een aantal fimbriae is geweten dat ze glycaan-afhankelijk interageren met fibronectine of laminine, wat onrechtstreeks hun interacties met integrinen zou kunnen bemiddelen. Algemene vraagstellingen 1) Wat is de structurele rol van proteïne-koolhydraat interacties en van de glycosylatie van de celreceptoren van de gastheer in de specificiteit en affiniteit van fimbriae van enterotoxigene E. coli (ETEC) en in E. coli biofilms? 2) Welke zijn de macromoleculaire, structurele aspecten van de interacties gemaakt tussen de fimbriële, multi-Igmodulaire polyadhesinen en hun receptoren en van de homotypische interacties in biofilms? 3) Hoe richt de fimbriële biogenese machinerie met de donorstreng complementatie en -uitwisseling zich naar celadhesie en -signalizatie? In hoeverre zijn er parallellen te trekken met eukaryote celadhesie en in welke mate maken pathogene bacteriën van dezelfde celadhesie en -signalizatie mechanismen en -toegangspoorten gebruik? Studieonderwerpen en uitvoering in functie van de algemene vraagstellingen en de voorziene technieken ETEC fimbriae die darminfecties veroorzaken bij dieren vormen het studieonderwerp om twee hoofdredenen. Langs de kant van de bacterie wordt er met ETEC fimbriële systemen al meteen een grote voorsprong gemaakt door het bestaan van de bijzondere polyadhesinen (F4, F5), waarvan de hoofdpilinen (SDAs) de adhesieve eigenschappen dragen. Een aantal ETEC fimbriae (F4, F5, F6, F17 en F18) zijn reeds onder studie in het laboratorium. Tevens bestaat er de mogelijkheid om polyadhesinen aan te maken via het aaneenrijgen van TDA suikerbindende domainen (F17, F18). Periplasmatische chaperons, de usher, en de adhesinen zullen deel uitmaken van deze doctorale studie. Het aanwenden van meerdere fimbriële systemen verhoogt de slagingskansen op voldoende expressie van deze moeilijke constructies. Er is evenwel een focus op F4 (fae, Fig. 1) en F6 (fas, Fig. 2) fimbriae. F6 fimbriae hebben het FasG TDA, waarvan het stabiele suikerbindingsdomein aangemaakt kan worden. F4 fimbriae lenen zich tot het construeren van multimodulaire polyadhesinen van donorstreng-gecomplementeerde SDAs. Langs de kant van de gastheer wordt de keuze voor fimbriae van dierlijke enterotoxigene E. coli gemotiveerd door de toegang tot intestinale microvilli van receptor-positieve biggetjes en enterocytculturen [10]. Zowel monolagen van enterocyten als het intestinaal epithelium gedifferentiëerd met microvilli zullen gebruikt worden voor het testen van de interacties met de ETEC stammen. Dat is belangrijk voor de studie van bacteriële adhesie, invasie en signaaltransductie in hun celbiologische context. 1) Rol van glycosylatie van receptoren voor de fimbriae in ETEC adhesie. Asparagine-gebonden glycanen worden geëxtraheerd vanaf de relevante intestinale microvilli, gezuiverd met behulp van HPLC en gekoppeld op microarrays, in samenwerking met Dr. Manfred Wuhrer aan het Leids Universitair Medisch Centrum [11]. Met deze unieke glycaan arrays zal er gezocht worden naar de natuurlijke koolhydraatreceptoren voor de fimbriae. Simultaan wordt voorkomen dat de meest specifieke glycaanreceptoren gemist worden, wat een probleem is met synthetische glycaan arrays. Eerst wordt er met de microvilli zowel bacteriële adhesie als inhibitie daarvan getest. Hemagglutinatie, Western blots en ELISA-overleganalyses laten toe dieper in te gaan op de opgepikte of eerder geïdentificeerde receptoren. Eén van de reeds beschreven glycoproteïnereceptors voor F4 fimbriae is het lactadherine, aanwezig in zeugenmelk [12]. Het draagt het RGD motief voor integrinen dat onrechtstreeks celadhesie zou kunnen bemiddelen. Surface plasmon resonance (SPR), dual polarization interferometrie (DPI) en isothermische titratie calorimetrie (ITC) zullen gebruikt worden om de thermodynamische en kinetische parameters van de interacties tussen de adhesinen en hun suikerreceptor en hun conformationele veranderingen, volgend op de binding, te meten. 2) Multi-Ig-domeinen van het F4 SDA. De Ig-vouwing, die typisch is voor adhesiemoleculen van eukaryoten [13], werd veelvuldig geadopteerd in virulentiefactoren van de bacteriële celenvelope. Fimbriae of pili zijn opgebouwd uit Ig-modules en zijn ondanks hun niet-covalente natuur uiterst stabiel. Het mechanisme van donorstreng complementatie geeft hen bovendien bijkomende voordelen, zoals de flexibiliteit om via inter-Ig-domein interacties 3 - 3 - structurele veranderingen te dirigeren die een invloed hebben op de affiniteit voor hun receptoren [7]. Fimbriae associëren immers graag met gelijkaardige, lineaire assemblages van eukaryote celadhesie en/of -signaalmoleculen, zoals CD55, een Dr fimbriae receptor op humane uroepitheliale cellen, of CD48 herkend door type 1 pili. We vermoeden dat er ook zo'n associatiegedrag bestaat tussen fimbriae in biofilms [2]. Het is momenteel absoluut onduidelijk welke rol glycanen spelen in deze interacties en waarom ze deze interacties inhiberen. Een combinatie van de benaderingen op de algemene vraagstellingen kunnen ongetwijfeld bijdragen tot meer inzicht. Er zal getracht worden om multi-Ig-adhesinen van het F4 SDA met een gecontroleerde lengte aan te maken. Het obstakel van het donorstreng mechanisme kan daarbij overkomen worden door de juiste donorstreng complementatie te kennen zowel in het chaperon-SDA complex als in de finale, veranderde conformatie van het SDA in de fimbria. Een recente grote doorbraak in het laboratorium was het zuiveren van een covalent donorstrenggecomplementeerd F4 SDA, dat zal gebruikt worden als bouwsteen voor de multimodulaire, lineaire associaties. Er zal nagegaan worden hoe de F4 multi-Ig-domein genproducten interacties bewerkstelligen met hun receptoren door middel van de SPR, DPI en ITC technieken. Mogelijk bemiddelen polyadhesinen hogere ordes van oligomerizatie met de (geglycosyleerde) receptorproteïnen (trans) of in biofilms (cis), waardoor er een dimensie aan de specificiteit kan worden toegevoegd zoals modulatie van intracellulaire [13] of immunologische reacties [14]. Tussen type 1 pili en het 1-2 ?m-lange fibervormende THP vinden hoogstwaarschijnlijk zulke interacties plaats [15]. Structurele karakterizatie van dit alles zal gebeuren enerzijds door kristalstructuren van de Ig-modulen en anderzijds door de combinatie van technieken die toelaten om de grootte, vorm, conformationele veranderingen en interactiedomeinen in grote, macromoleculaire complexen te bestuderen. Instrumentatie en expertise daartoe voorhanden zijn gelfiltratie, multihoek statische lichtscattering, dynamische lichtscattering, ultracentrifugatie, kleine-hoek X-stralen verstrooïng in oplossing aan de synchrotron, electronenmicroscopie en atomische krachtmicroscopie. 3) Fimbriële biogenese. De bedoeling is om ook de invloed van reeds covalent aaneengeschakelde F4 SDAs op de fimbriële biogenese te gaan bekijken. Het is waarschijnlijk dat reeds gecomplementeerde SDAs de usher permanent blokkeren en dus geen openen en sluiten van de usher meer toelaten (na te gaan met de black lipid membrane (BLM) technologie) wegens het wegvallen van de donorstrenguitwisseling. In onze opinie heeft dat als voordeel dat het gevormde, geblokkeerde complex mogelijk beter gekristalliseerd kan worden dan de usher op zich, en bovendien een eerste beeld kan geven van de doorgang van pilinen doorheen een usher. F6 fimbriae (fas, Fig. 2) zijn een mooi studieonderwerp voor fimbriële biogenese met nog twee extra, kleine chaperons naast het klassieke chaperon FasB. FasC is een adhesine-specifiek chaperon, terwijl FasE zorgt voor de optimale export van FasG doorheen de usher [16]. Adhesine-specifieke chaperons zijn uniek voor fas en CS (humane ETEC) fimbriële operons. De interacties van FasC en FasE met FasG zullen bepaald worden onder andere in kristalstructuren