Opheldering van de rol van connexine eiwitten in hepatocellulaire apoptotische dood.

1) Situering en motivatie van het onderzoeksproject Pre-klinisch farmaco-toxicologisch onderzoek wordt vooral uitgevoerd op levende proefdieren. Vanuit ethische, economische en wetenschappelijke hoek groeit er meer en meer interesse om voor dit doeleinde het aantal in vivo experimenten te reduceren. Een van de basisvereisten waaraan in vitro modellen voor deze doelstelling moeten voldoen is het tot expressie brengen van specifieke gedifferentieerde functies op in vivo niveau en dit gedurende lange termijn [1]. De dienst FAFY heeft zich de voorbije jaren gespecialiseerd in de ontwikkeling van dergelijke lange-termijn hepatocytencultuursystemen waarbij verschillende strategieën werden gevolgd [2-19]. Sinds 1999 wordt binnen de dienst FAFY onderzoek verricht naar een nieuwe methode om cultivatie van primaire hepatocyten op lange termijn mogelijk te maken. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van histone deacetylase inhibitoren als cultuurmedium additieven, dewelke hyperacetylatie van kernhistonen veroorzaken en dus veranderingen in genexpressie. De dienst FAFY heeft ondermeer aangetoond dat deze moleculen proliferatie en apoptose van primair gecultiveerde hepatocyten afremmen, terwijl het behoud van hun gedifferentieerd fenotype sterk bevorderd wordt [20-25]. Hieruit groeide de idee om de effecten van histone deacetylase inhibitoren op intercellulaire communicatie te bestuderen. Dit project werd in 2001 opgestart door de aanvrager van het huidige project, in het kader van het behalen van een doctoraat in de farmaceutische wetenschappen. Uit dat doctoraatsonderzoek blijkt dat histone deacetylase inhibitoren intercellulaire communicatie, gemedieerd door gap junctions, sterk bevorderen in primaire hepatocytenculturen. Dit gaat gepaard met verschillende effecten op de expressie van connexines, de bouwstenen van gap junctions [26,27]. Anderzijds blijkt uit dit onderzoek ook dat connexines zich op verschillende manier gedragen tijdens proliferatie van hepatocyten [28]. Hieruit ontstond de hypothese dat individuele connexines mogelijks een specifieke rol vertolken in de regulatie van de hepatocellulaire homeostase, hetgeen zal onderzocht worden in de eerste fase van het vooropgestelde onderzoeksproject. Uit dat initieel onderzoek zal blijken welk(e) connexine(s) vooral van belang is (zijn) voor het uitvoeren van leverspecifieke functionaliteit. Dit vormt dan weer de basis voor het tweede luik van het huidige project, namelijk transfectie van primaire gecultiveerde hepatocyten met een welbepaald connexine gen ter stabilisatie van het gedifferentieerd fenotype. 2) Doelstellingen Het voorgestelde project heeft 2 doelstellingen. (i) Het ophelderen van de specifieke rol van individuele connexines, namelijk Cx32 en Cx26, in de controle van de hepatocellulaire homeostase. In het bijzonder wordt toegespitst op hun functies in cellulaire proliferatie, differentiatie en apoptose. (ii) Het ontwikkelen van primaire hepatocytenculturen die voor lange termijn studies aangewend kunnen worden. Daartoe wordt gebruik gemaakt van transfectie van primair gecultiveerde hepatocyten met welbepaalde connexine genen.