In vitro and in vivo studies on the role of the IRAP enzyme/AT4 receptor system in learning and memory processes.

Inleiding

Angiotensine II (Ang II) werd jarenlang beschouwd als het eindproduct van de renine-angiotensine cascade. Ang II kan 2 soorten receptoren stimuleren, namelijk AT1 en AT2 receptoren. Angiotensine conversie enzyme inhibitoren en AT1 receptorantagonisten zijn beide op de markt om hypertensie te behandelen. Recente ontdekkingen in dit vakdomein tonen echter aan dat er verschillende additionele effectorpeptiden bestaan met uiteenlopende functies (review Vauqueline te al., 2002).

Het hexapaptide Ang IV (VYIHPF) ontstaat uit Ang II door enzymatische afsplitsing van 2 N-terminale aminozuren en veroorzaakt een waaier van centrale en perifere fysiologische functies, waaronder een verbetering van leertaken en geheugen in normale proefdieren, het omkeren van geheugenverlies in diermodelen van amnesie en een regulatie van de renale hemodynamica en natriumhuishouding.

De cellulaire bindingsplaatsen voor het Ang IV werden gekarakteriseerd als AT4 receptoren (de Gasparo et al., 2000), aanwezig in grote mate in hersenregio's betrokken in cognitie en geheugen (zoals cortex en hippocampus) maar ook in de verschillende perifere weefsels.

Dit onderzoeksdomein kreeg echter een totaal nieuwe wending door de resultaten van Albiston et al. (2001), die documenteerden dat de AT4 receptor geen G-proteïne gekoppelde receptor is maar een enzyme. Dit enzyme heeft verschillende namen afhankelijk van het weefsel waar het eerst door verschillende onderzoekers werd ontdekt, maar eigenlijk staan IRAP = insulin-regulated aminopeptidase, P-LAP = placental leucine aminopeptidase en Otase = oxytocinase voor eenzelfde enzyme. De Australische onderzoeksgroep van Albiston leverde in alle geval baanbrekend in vitro werk (Albiston et al., 2001; Lew et al., 2003; Lee et al., 2003): 1) de peptidesequentie van de AT4 receptor en IRAP was analoog; 2) HEK cellen getransfecteerd met IRAP vertonen typische AT4 receptor bindingskarakteristieken voor Ang IV; 3) de distributie in de hersenen van het IRAP proteïne en zijn mRNA, bepaald door immunohistochemische technieken en hybridizatie histochemie, zijn parallel met de radioligandbinding van [125I]Nle1-Ang IV aan de AT4 receptor; 4) de endogene AT4 receptorliganden, Ang IV en LVV-hemorphine-7, en de synthetische analogen, Nle1-Ang IV en divalinal-Ang IV, zijn potente inhibitoren van de katalytische activiteit van IRAP maar worden zelf niet door IRAP gemetaboliseerd; 5) structuur-activiteitsrelaties van LVV-hemorphine-7 toonden aan dat een minimale sequentie van 5 aminozuren nodig is voor hoge affiniteitsbinding aan IRAP en inhibitie van IRAP.



Hypothese en doelstellingen

Dit project beoogt een kritische evaluatie van deze werkhypothese dat IRAP inderdaad de AT4 receptor is, en dat het IRAP enzyme/AT4 receptor systeem de belangrijkste cellulaire binding- en signaaltransductieplaats is voor Ang IV in het centraal zenuwstelsel



We beogen 3 concrete doelstellingen:

(i) Identificatie en karakterisatie van het IRAP enzyme/AT4 receptor systeem in neuronale cellen in vitro. Dit zal gebeuren door meting van de ligandbinding, enzymatische activiteit en mogelijke signaaltransductiemechanismen in cellen en in hersencoupes en hersenhomogenaten.

(ii) Onderzoek naar de betrokkenheid en de werkingsmechanismen van het IRAP enzyme/AT4 receptor systeem in leer- en geheugenprocessen door kwantificeren van het gedrag in gevalideerde gedragstesten na i.c.v. of intrahippocampale/intracorticale applicatie van IRAP/AT4 liganden. Deze experimenten zullen uitgevoerd worden in normale laboratoriumratten en –muizen en in een verder stadium van het project ook in modellen voor de ziekte van Alzheimer.

(iii) Onderzoek naar de in vivo fysiologische relevantie van activatie en modulatie van het centraal IRAP enzyme/AT4 receptor systeem door het meten van de neurotransmitter- en neuropeptidevrijgave in ratten en muizen, alsook in IRAP¨KO muizen.