In-vitro differentiatie van humane embryonale stamcellen tot primordiale kiemcellen en mannelijke gameten.

Wanneer kankerpatiënten chemo- en/of radiotherapie krijgen voor de behandeling van hun ziekte, kan hun fertiliteit hierdoor aangetast worden. De kankertherapieën hebben namelijk een effect op alle snel delende cellen en dus ook op de spermatogoniale stamcellen. Aangezien bij prepubertaire jongetjes de spermatogenese nog niet gestart is, kan geen spermastaal ingevroren worden en zijn deze stamcellen hun enige bron van fertiliteit voor de toekomst. Om deze prepubertaire patiënten te helpen zijn er verschillende strategieën mogelijk. De eerste strategie behelst de PRESERVATIE van de fertiliteit door de cryopreservatie van de spermatogoniale stamcellen vóór de start van de behandeling. Deze stamcellen zouden dan later tot proliferatie, differentiatie en maturatie kunnen aangezet worden via autologe intratesticulaire transplantatie of via weefseltransplantatie. De tweede strategie houdt de REGENERATIE van de fertiliteit in. Hierbij zouden embryonale stamcellen in-vitro gedifferentieerd worden via primordiale kiemcellen tot mannelijke gameten. Deze laatste strategie zou bovendien kunnen bijdragen tot de kennis van de factoren die kunnen zorgen voor de segregatie tussen de kiemcellijn en de somatische cellijnen en het sturen van de proliferatie van kiemcellijnen. Hoewel dit doctoraat zich op de tweede strategie toespitst, werd ook de eerste strategie (waarvoor tijdens de licentiaatstage al experimenten gebeurden) verder uitgewerkt. Deze strategie behelst dus de cultuur, differentiatie en maturatie van spermatogoniale stamcellen, al dan niet in-vitro en de nadruk lag hierbij op vruchtbaarheidspreservatie bij prepubertaire kankerpatiëntjes, vooral met het oog op mogelijke maligniteit bij autologe intratesticulaire transplantatie van testiculaire stamcellen. Een groot probleem voor de klinische toepassing van deze techniek is namelijk de mogelijke contaminatie van testisweefsel met tumorcellen in geval van leukemie of tumoren die metastasen vormen via de bloedbaan. Transplantatie van deze cellen zou een maligne relaps kunnen veroorzaken, wat ten stelligste moet vermeden worden. Er werden twee verschillende strategieën onderzocht die de fertiliteit van kinderkanker patiëntjes zouden kunnen herstellen zonder het risico op maligniteit. In een eerste opzet werd gebruik gemaakt van xenografting van testiculair weefsel naar immuundeficiënte muizen. In de studie werd subcutane grafting van prepubertair murien, adult murien en adult humaan testisweefsel vergeleken in twee immuundeficiënte muismodellen, namelijk Swiss Nude en SCID-NOD muizen. De belangrijkste conclusies van deze studie waren dat: 1) spermatogonia langer dan 195 dagen konden behouden worden na xenografting van adult humaan testisweefsel naar een immuundeficiënte muis; 2) het getransplanteerde weefsel een meer 'immature' ontwikkelingsstatus moet hebben om de techniek van xenografting te staven als een methode voor externe kiemcel bewaring en 3) bovendien, niet alleen de ontwikkelingsstatus van het weefsel op het moment van de grafting, maar ook de structurele organisatie van het seminifere epitheel de ontwikkeling van het weefsel zou kunnen beïnvloeden. De resultaten van deze studie werden gepubliceerd in Human Reproduction in februari 2006. De tweede studie was gebaseerd op de intratesticulaire stamceltransplantatie, een techniek waarmee onze onderzoeksgroep al veel ervaring heeft. Er werd getracht om muriene en humane testiculaire celsuspensies, besmet met tumorcellen, te decontamineren door middel van magnetische en fluorescentie geactiveerde cel sortering (respectievelijk MACS en FACS). Bovendien werd getracht de muriene celsuspensies aan te rijken aan spermatogoniale stamcellen om de efficiëntie van de intratesticulaire stamceltransplantatie te verhogen. Uit deze studie konden we concluderen dat MACS en FACS niet voldoende zijn voor een volledige depletie van maligne cellen in testiculaire celsuspensies. Meer onderzoek naar alternatieve decontaminatie methoden is zeker nodig, maar de ontwikkeling van een betrouwbare techniek om het testiculaire weefsel apriori te screenen voor contaminatie is minstens even belangrijk. De resultaten van de decontaminatie experimenten werden gepubliceerd in Human Reproduction in 2007 (2006 Nov 16; [Epub ahead of print]). Voor de tweede strategie (in-vitro differentiatie van humane embryonale stamcellen tot primordiale kiemcellen en mannelijke gameten) werden in de eerste fase van dit doctoraat eerst de basistechnieken van derivatie, cultuur en differentiatie van humane embryonale stamcellen (hES) aangeleerd. De derivatie van embryonale stamcellen gebeurt door middel van "immunosurgery" op geëxpandeerde blastocysten (embryo van ongeveer 6 dagen oud). Deze blastocysten werden afgestaan voor onderzoek door fertiliteitpatiënten. De kiemknop die uit het embryo geïsoleerd wordt, wordt op een voedingsbodem van muis embryonale fibroblasten (MEF) uitgeplaat. Wanneer deze cellen prolifereren, kunnen ze gepassageerd worden naar een nieuwe voedingsbodem en op deze manier in cultuur gehouden. Op dit moment, hebben we in ons laboratorium 9 hES cellijnen afgeleid. VUB01 (46XY), VUB02(46XY), VUB06 (47XX+17) en VUB_07 (46XX) zijn uit normale in vitro gekweekte blastocysten afgeleid. De VUB03_DM1, VUB04_CF (46XX), VUB05_HD (46XY), VUB08_MF (46XX), VUB09_FSHD hES cellijnen werden afgeleid uit embryo's die na preimplantatie genetische diagnose (PGD) voor respectievelijk myotone dystrofie type1 (DM1), mucoviscidose (CF), de ziekte van Huntington (HD), het syndroom van Marfan (MF) en Facioscapulo humerale dystrofie (FSHD) aangetast of drager bleken te zijn. Om de cellijnen die op deze manier ontstaan te karakteriseren, wordt een analyse gemaakt van hun zelfvernieuwende capaciteit en hun pluripotentie in-vitro en in-vivo. Zeven hES lijnen (VUB_09 werd nog niet onderzocht) toonden een normaal karyotype. VUB06 vertoont een trisomie van chromosoom 17. In alle lijnen werd een positieve alkaline fosfatase activiteit aangetoond. De aanwezigheid van de transcriptie factoren Oct-4 en Nanog, die merkers van pluripotentie zijn, werd door middel van RT-PCR aangetoond. Na spontane in-vitro differentiatie van de cellen, werd expressie van alfa foetoproteine (merker voor endodermale differentiatie) en human chorionic gonadotrophin (merker voor mesodermale differentiatie) gevonden. Verschillende celoppervlakte merkers (SSEA-3, -4, TRA-1-60, TRA-1-80) werden opgespoord dmv immunocytochemie. Het vermogen van differentiatie in-vitro werd aangetoond via de vorming van "embryoid bodies" waarin weefsels afkomstig van de drie kiemlagen moeten aanwezig zijn. Het vermogen van differentiatie in-vivo werd geëvalueerd door de vorming van teratomas na inspuiting van hES cellen in een SCID muis. De instandhouding van een hES cellijn is moeilijk omdat de cellen spontaan differentiëren. Frequent passageren van de kolonies naar nieuwe MEF-voedingsbodems van goede kwaliteit is noodzakelijk. Het passageren moet om de vier à vijf dagen gebeuren. Het medium moet elke dag ververst worden. Het medium bevat knock-out DMEM met knock-out serum replacement (20%), LGlutamine (2mM), non-essential amino-acids (1%), 2-mercapto-ethanol (0.1mM) en human recombinant basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) (4ng/ml).