Prolinebiosynthese in verband met osmotische adaptatie bij hogere planten : een moleculaire en fysiologische benadering

Projectdetails

!!Description

Fysiologische karakterisatie van mutante tabaksplanten gewijzigd in proline accumulatie.



Onderzoeksproject OZR 370. Promotor: G. Angenon (PLAN; voorheen M. Jacobs, PLAN). Co-promotor: L. Slooten (DNTK). Verslag over de periode van 1 jan 1999 tot 31 december 2001, ingediend door L. Slooten.



Inleiding.



Proline productie is één van de verdedigingsmechanismen van planten tegen osmotische stress. Proline biosynthese vindt plaats langs twee alternatieve wegen, vertrekkende van resp. glutamaat of ornithine [1]. Sleutel-enzymen hierin zijn resp.Delta-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) en ornithine-d-aminotransferase (d-OAT). P5CS is onderhevig aan feedback inhibitie door proline. In het laboratorium voor Plantengenetika werden mutanten van Nicotiana plumbaginifolia geselecteerd waarin deze feedback inhibitie sterk verminderd is [2]. Dit blijkt het gevolg te zijn van een single-point mutatie die resulteerde in de wijziging van één aminozuur in het P5CS protein [3]. Wanneer één van deze mutanten (RNa genoemd), en het wildtype (P2) blootgesteld worden aan zoutstress, neemt het prolinegehalte in beide sterk toe, maar in RNa meer en vooral sneller dan in P2 [3]. RNa was ook aanzienlijk toleranter voor osmotische stress dan wildtype planten [2]. De bedoeling van dit project was om verschillende proline onder- of overproducerende transformanten te genereren, en deze fysiologisch te karakterizeren, onder meer wat betreft prolinegehalte en osmotolerantie. Eerst zou de RNa mutant van N. plumbaginifolia vergeleken worden met het wildtype (P2). De experimenten die de meest significante resultaten gaven, zouden dan worden geselecteerd voor nader onderzoek van de nog te genereren transformanten van A. thaliana.



Methoden.



Planten werden gekweekt in een fytotron of in een kweekkamer met RH 80-85%, 12/12 uur dag/nachtlengte, en regelbare temperatuur en lichtintensiteit (in PAR; 1 E = 1 mol quanta.m-2.s-1). Planten werden gezaaid op potgrond. Voor het aanleggen van zoutstress werden 31-33 dagen oude plantjes van de meeste potgrond ontdaan en overgebracht in potjes met vermiculiet die tweemaal met demiwater was gespoeld. Vanaf drie dagen na het overplanten werden de vermiculiet om de andere dag van bovenaf doorgespoeld met een voedingsoplossing (Mn medium [4]) die tweemaal per week werd ververst. Bij testplantjes werd aan de voedingsoplossing NaCl en CaCl2 toegevoegd (zie onder). Proline werd bepaald volgens Bates [5]. De chlorofyl fluorescentieparameter Fv/Fm werd gemeten zoals eerder beschreven [6]. Resultaten worden gegeven als het gemiddelde en fout op het gemiddelde (SE), meestal voor 4 tot 6 planten, tenzij anders aangegeven. De significantie van verschillen (p) werd bepaald in een tweezijdige Student t-test.



Resultaten.



1. Het prolinegehalte is in stengelbladen van N plumbaginifolia plm 2-5 maal hoger dan in rozetbladen. Het prolinegehalte neemt een factor 10 tot 50 toe in respons op koude-, droogte- en zoutstress, maar niet in respons op warmtestress. Omgekeerd leek proline-biosynthese geen bescherming te bieden tegen daaropvolgende behandeling met hoge temperaturen.

2. RNa vormt wat meer biomassa en loopt in ontwikkeling wat vooruit in vergelijking met P2. Het verschil in biomassa ontstaat in de eerste zes weken na het zaaien; daarna is er geen duidelijk verschil meer in relatieve groeisnelheid.

3. Wanneer jonge rozetplantjes (plm 42 dagen oud) worden blootgesteld aan zoutstress leidt dat tot remming van de vorming van nieuwe rozetbladen, en tot remming van de stengelgroei. RNa is daar iets minder gevoelig voor dan P2. Het prolinegehalte van zoutgestresste planten is in RNa echter niet hoger dan in P2. Opmerkelijk is verder dat de relatieve groeisnelheid (gemeten aan de toename in het totaal bladoppervlak) weinig of niet beïnvloed werd door zoutstress. Het achterwege blijven van de vorming van nieuwe bladen in planten onder zoutstress werd nl. gecompenseerd door verdere groei van de reeds eerder gevormde bladen.

4. Remming van de bladvorming bleef grotendeels achterwege indien de aanvang van de zoutstress een week werd uitgesteld. Het verschil in gevoeligheid voor zoutstress tussen P2 en RNa was dan ook te verklaren door aan te nemen:

a. Dat zoutstress schade toebrengt aan het topmeristeem

b. Dat deze schade geringer is naarmate de orgaan-differentiatie van het topmeristeem verder gevorderd is bij de aanvang van de zoutstress

c. Dat de differentiatie op het moment van de aanvang van de zoutstress in RNa iets verder gevorderd was dan in P2.

5. Het prolinegehalte neemt in respons op droogtestress (zie punt 1) in RNa niet meer toe dan in P2. Er was visueel ook geen verschil in gevoeligheid voor droogtestress tussen RNa en P2.

6. Het prolinegehalte neemt in respons op koudestress (zie punt 1) in RNa meer toe dan in P2. Afgemeten aan het effect van koudestress op de relatieve groeisnelheid, en aan visuele kenmerken, is RNa echter niet beter bestand tegen koudestress dan P2.



Conclusies en vooruitzichten.



1. We hebben de zout-tolerantie van RNa in vergelijking met P2 niet kunnen bevestigen. Ook in andere stress situaties was er geen verhoogde osmotolerantie van RNa in vergelijking met P2 aantoonbaar. Het is echter nog denkbaar dat een verschil in zouttolerantie kan worden aangetoond in de kiemings- en eerste groeifase. Dat kan nog getest worden.

2. Anderzijds hebben we met deze experimenten nuttige ervaring opgedaan voor wat betreft het aanleggen van verschillende varianten van osmotische stress; ervaring die gebruikt kan worden bij het vergelijken van transformanten die proline onder- of overproduceren.

3. Bij het voortzetten van deze experimenten verdient het aanbeveling de vermicultiet te vervangen door een drager die minder stresserend werkt.

4. Zelfs afgezien van het effect van koude of zout op het topmeristeem, lijken jonge planten aanmerkelijk gevoeliger voor zout- of koude stress dan oudere planten. Het lijkt de moeite waard om te onderzoeken hoe dat komt, dmv onderzoek naar gen-expressie, enzym-activiteiten en fysiologische parameters.



BIBLIOGRAFIE

[1] Roosens NHCJ, Thu TT, Iskandar HM, Jacobs M (1998). Isolation of the ornithine- -transferase cDNA and effect of salt stress on its expression in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol 117: 263-271.

[2] Sumaryati S, Negrutiu I, Jacobs M (1992) Characterization and regeneration of salt- and water-stress mutants from protoplast culture of Nicotiana plumbaginifolia (Viviani) Theor Appl Genet 83: 613-619.

[3] Roosens NH, Willem R, Li Y, Verbruggen I, Biesemans M, Jacobs M (1999) Proline metabolism in the wild-type and in a salt-tolerant mutant of Nicotiana plumbaginifolia studied by 13-C magnetic resonance imaging. Plant Physiol 121:1280-1290.

[4] Negrutiu I, Dirks R, Jacobs M (1983) Regeneration of fully nitrate reductase deficient mutant from protoplast culture of Nicotiana plumbaginifolia (Viviani). Theor Appl Genet 66: 341-347

[5] Bates LS (1973) Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant Soil 39: 205-207.

[6] Van Camp W, Capiau K, Van Montagu M, Inzé D, Slooten L (1995) Enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco plants overproducing Fe-superoxide dismutase in chloroplasts. Plant Physiol 112: 1703-1714.



AcroniemOZR370
StatusGeëindigd
Effectieve start/einddatum1/01/9931/12/01

Flemish discipline codes in use since 2023

  • Biological sciences
  • Materials engineering

Vingerafdruk

Verken de onderzoeksgebieden die bij dit project aan de orde zijn gekomen. Deze labels worden gegenereerd op basis van de onderliggende prijzen/beurzen. Samen vormen ze een unieke vingerafdruk.