Spermatogoniale stamceltransplantatie: (epi)genetische aspecten.

In België ontwikkelen ongeveer één op 6000 kinderen kanker vóór de leeftijd van 15 jaar. Dankzij verbeterde behandelingsmethoden (chemo- en radiotherapie) is de overlevingskans nu meer dan 80%. Er wordt geschat dat tegen 2010 één jong-volwassene op 250 een overlever van kinderkanker zal zijn. Hoewel, als een gevolg van hun ziekte en behandeling krijgen deze lange-termijn overlevers hun verdere leven te maken met significante nevenwerkingen. Eén van de ongewenste effecten van de aggressieve kankerbehandelingen is dat patiënten hun fertiliteit verliezen. Chemotherapie vernietigt niet alleen de maligne cellen, maar ook andere delende cellen, oa spermatogene cellen, zodat subfertiliteit of infertiliteit optreedt. Een bepaalde groep van kinderen, vooral diegene die aggressieve behandelingen nodig hebben, waaronder chemotherapie en beenmergtransplantatie riskeren levenslange infertiliteit. Het is evident dat preventie van steriliteit speciale aandacht verdient zowel in de oncologische als in de reproductieve geneeskunde. Bij volwassenen mannen kan inbanken van sperma vóór aanvang van de behandeling een oplossing bieden. Voor pre-pubertaire jongens, daarentegen, is dit geen optie, wegens het compleet ontbreken van spermatogenese in hun testes. In vrouwelijke patiënten werd preventieve cryopreservatie van ovarieel weefsel reeds uitgevoerd en recentelijk heeft dit zelfs tot zwangerschappen geleid. In analogie met deze strategie zou het bewaren van pre-pubertair testisweefsel een potentiële oplossing kunnen bieden voor jonge kankerpatiëntjes. Na de behandeling, zou theoretisch gezien ingevroren en ontdooide stamcellen terug getransplanteerd kunnen worden met de bedoeling dat de spermatogenese terug opstart. Met onderzoeksgeld van het FWO en de Onderzoeksraad van de VUB werden de basistechnieken voor dit onderzoek geïntroduceerd. Tijdens de afgelopen jaren werd onderzoek verricht in een muismodel naar de efficiëntie en de veiligheid van testiculaire stamceltransplantatie na natuurlijke reproductie en na in-vitro fertilisatie en intracytoplasmatische sperma injectie. De studies betreffende efficiëntie en veiligheid van spermatogoniale stamceltransplantatie toonden verschillen aan in de pre- en postimplantatie embryonale ontwikkeling tov controles. Daarom is onderzoek naar de genetische en epigenetische aspecten van spermatogoniale stamceltransplantatie aangewezen alvorens over te gaan naar een eventuele klinische toepassing. In dit project zullen de genetische en epigenetische status van post-transplantatie spermatozoa en de nakomelingen van getransplanteerde mannetjes onderzocht worden in een muismodel. In eerste instantie zal nagegaan worden of spermatozoa verkregen na testiculaire stamceltransplantatie een normaal karyotype vertonen. Dit zal gebeuren door posttransplantatie spermatozoa te injecteren in een metafase-II eicel. Eicellen die pronuclei vertonen worden in nocodazole gebracht en een uur na het verdwijnen van de pronuclei worden de eicellen ontdaan van de zona pellucida en gefixeerd volgens de methode van Dyban (1983). Door middel van een Giemsa-kleuring wordt de chromosomale constitutie geëvalueerd. In tweede instantie zal nagegaan worden of bepaalde genen correct gemethyleerd zijn. Er zullen paternaal gemethyleerde genen (H19 en Igf2), maternaal gemethyleerde genen (Peg1/Mest en Lit1) en een 'non-imprinted' gen (?-actine) geanalyseerd worden dmv bisulfiet analyse, PCR en pyrosequencing. De resultaten zullen vergeleken worden met controle spermatozoa van fertiele mannetjesmuizen. Deze methylatie-analyse zal ook gebeuren op placenta, lever- en nierweefsel van eerste en tweede generatie nakomelingen van getransplanteerde muizen. Daarna zal de algemene methylatiestatus geanalyseerd worden op pre-implantatie embryo's van verschillende leeftijden (d1, d2, d3, d4 en d5). Deze analyse zal kwalitatief gebeuren adhv antilichamen gericht tegen gemethyleerd DNA en op een kwantitatieve manier adhv micro-array's. Aangezien de transcriptie ook beïnvloed wordt door de modificatie van histonen zal in een laatste fase de histonenmodificatie bestudeerd worden in post-transplantatie spermatozoa. Histonen zullen worden geëxtraheerd volgens de methode van Broday et al. (2000). De histonenpreparatie zal worden gescheiden op 15% SDS-PAGE gel, waarop een Western blot met antilichamen tegen verschillende histonenmodificaties zal gebeuren (oa. acetylatie van lysines in histon H3 en H4, methylatie, dimethylatie en trimethylatie van lysines in histon H3 en H4 en fosforylatie van serine 10 in histon H3).