Tracering van pancreatische transdifferentiatie.

Projectdetails

!!Description

Deze aanvraag situeert zich in het kader van het FWO-Onderzoeksproject G.0480.06 "Pancreatische exocriene-endocriene transdifferentiatie en betacel-regeneratie". In dit project wordt de regeneratie van betacellen in de diabetische pancreas bestudeerd. De werkhypothese is dat acinaire exocriene cellen in volwassen pancreas nog kunnen transdifferentiëren tot betacellen (1,2). Om dit te bestuderen werden in de onderzoeksgroep in vivo- en in vitro-onderzoeksmodellen opgesteld. Deze aanvraag is toegespitst op het ondubbelzinnig aantonen van exocriene-endocriene transdifferentiatie door middel van cellijn-tracering. We kunnen het voorgestelde project onderverdelen in twee delen, een in vivo en een in vitro model.





1) In vivo

In de onderzoeksgroep werd een methode ontwikkeld waarmee betacel-regeneratie kan geïnduceerd worden door farmacologische behandeling van muizen die vooraf diabeet werden gemaakt met behulp van alloxaan. De alloxaan-behandeling vernietigt meer dan 90% van de betacelmassa en de dieren blijven vervolgens hyperglycemisch. Wanneer ze behandeld worden met een combinatie van gastrine-hormoon en epidermale groeifactor (EGF), regenereert de betacelmassa en bekomen de dieren terug een normale glycemie en glucose-tolerantie (3). In deze omstandigheden, die binnen een tijdsspanne van één week plaatsgrijpen, werd er geen effect van de behandeling waargenomen op de replicatie van betacellen. Wel zijn er onrechtstreekse aanwijzingen voor de neogenese van betacellen uit insuline-negatieve precursorcellen. Dit laatste is gebaseerd op een bromodeoxyuridine pulse-chase experiment. Vooral ductale en acinaire exocriene cellen incorporeren dit thymidine-analoog tijdens hun replicatie. Wanneer er geen vrij bromodeoxyuridine meer voorradig is, stijgt toch het aantal gemerkte betacellen, hoewel dit niet kan verklaard worden door betacel-replicatie. Een andere aanwijzing die op transdifferentiatie duidt, is de immunocytochemische detectie van overgangscellen die zowel insuline als een exocriene celmerker uitdrukken (cytokeratine, amylase). Het opsporen van dergelijke overgangsvormen wordt echter bemoeilijkt doordat de cellen eerst hun exocriene kenmerken verliezen vooraleer hun endocriene kenmerken uit te drukken. Hierdoor wordt het belang van de transdifferentiatie onderschat.

Met cellijn-tracering kan transdifferentiatie ondubbelzinnig aangetoond worden, en kan het aantal cellen dat door transdifferentiatie is ontstaan geteld worden. Hiervoor zullen we gebruik maken van transgene muizen die ontwikkeld werden door D. Stoffers van de Universiteit van Pennsylvania. In deze muizen werd het reporter-gen "LacZ", dat codeert voor bacterieel beta-galactosidase, ingebouwd in het genoom onder controle van de constitutief actieve en algemeen uitgedrukte promoter "Rosa26". Echter, de reporter wordt vooraf gegaan door een transcriptie terminatie cassette (STOP-sequentie) die geflankeerd is door Lox-sites. Een tweede genconstruct werd geïncorporeerd, namelijk met daarin een gen dat codeert voor het Cre-recombinase enzyme (afkomstig van de bacteriofaag P1) onder controle van de amylase-promoter (pAmy). In cellen die amylase tot expressie brengen, de acinaire exocriene cellen van de pancreas, zal het Cre-recombinase enzyme gemaakt worden. Dit enzyme katalyseert de recombinatie tussen de twee Lox-sites waarbij de tussenliggende sequentie verloren gaat. De STOP-sequentie zal dus blijvend verwijderd worden en in deze cellen zal de LacZ reporter tot expressie komen (cytochemisch aan te kleuren)(4). Acinaire cellen die de amylase-expressie stopzetten, zullen de reporter blijven uitdrukken vermits die na Cre-recombinatie constitutief tot expressie blijft. Indien dergelijke cellen vervolgens insuline gaan uitdrukken (transdifferentiatie), blijven ze gemerkt door de reporter. Men zou dan immunohistochemisch insuline-positieve cellen kunnen aantonen die, als ze ook de reporter uitdrukken, van acinaire cellen afkomstig moeten zijn. In de transgene muizen die we hiervoor ter beschikking hebben, kan het Cre-recombinase pas overgeschreven worden wanneer er inductie plaatsgrijpt door tamoxifen (pAmylase-Cre-ERT). Cre-ERT is een fusieproteïne tussen het katalytisch domein van het Cre-recombinase en het ligand-bindend domein van een gemodifieerde oestrogeen receptor. ERT (estrogen receptor tamoxifen inducible) heeft als ligand tamoxifen, een antagonist van oestrogeen (5). In afwezigheid van tamoxifen blijft Cre-ERT in het cytoplasma door binding aan heat shock proteins bv. Hsp90, Hsp70. Toediening van tamoxifen resulteert in de dissociatie van deze binding en migratie van het Cre-ERT complex naar de nucleus, waar Cre de STOP-sequentie voor de reporter zal kunnen verwijderen. De proefdieren moeten dus behandeld worden met tamoxifen om de reporter uit te drukken. Een eventueel effect van tamoxifen zal eerst moeten nagegaan worden, wat betreft herstel van de glycemie en betacel-regeneratie in ons experimenteel model. Aankleuren van galactosidase (LacZ) door enzym cytochemie zal gecombineerd worden met insuline immunohistochemie op vriescoupes van pancreas. Dubbel-positieve cellen zijn afkomstig van acinaire cellen. In de groep bestaat reeds ervaring met deze methodologie.

Er zal ook nagegaan worden of exocriene-endocriene transdifferentiatie plaatsgrijpt onder normale fysiologische omstandigheden.



2) In vitro

In de onderzoeksgroep werd ook een methode ontwikkeld waarmee betacel-neogenese kan geïnduceerd worden in celculturen van rat acinaire exocriene pancreascellen. Acinaire cellen de-differentiëren tijdens de eerste 4 dagen van de cultuur, waarbij ze hun exocriene kenmerken verliezen. Wanneer ze vervolgens worden behandeld met een combinatie van EGF en LIF (leukemie-inhiberende factor), worden in een tijdsspanne van drie dagen talrijke insuline-producerende cellen gevormd. Deze cellen bevatten een insuline-inhoud die vergelijkbaar is met die van betacellen uit eilandjes van Langerhans, drukken ook andere betacel-merkers uit (C-peptide, glucose transporter-2 en de transcriptiefactor Pdx-1 (pancreas-duodenum homeobox 1)), en secreteren insuline in respons op glucose-stimulatie. Na transplantatie in diabete proefdieren herstellen ze daar de glycemie (6). Ook hier treedt geen significante betacel-replicatie op, en heeft een bromodeoxyuridine pulse-chase experiment aangetoond dat nieuwe betacellen ontstaan vanuit insuline-negatieve precursorcellen. Overgangsvormen konden worden aangetoond die amylase en insuline uitdrukken.

Om de transdifferentiatie van acinaire tot betacellen ondubbelzinnig aan te tonen in dit model, wensen we hier ook cellijn-tracering uit te voeren. Hiervoor beschikken we over twee constructen die we via adenovirale of lentivirale transductie in de acinaire cellen willen tot expressie brengen. In het eerste construct, het reporterconstruct, zitten twee verschillende reporter-genen (Red fluorescent protein RFP en enhanced green fluorescent protein EGFP) die constitutief tot expressie worden gebracht. RFP wordt geflankeerd door Lox-sites. EGFP wordt voorafgegaan door een nucleair lokalisatie signaal (NLS). Hierdoor zal het EGFP enkel tot expressie komen in de kern en RFP in het cytoplasma. In het andere construct, het promoterconstruct, zit het Cre-recombinase gen onder de controle van de amylase-promoter. Dubbel getransduceerde cellen zullen dus via het Cre-recombinase de rode reporter uitknippen en enkel EGFP uitdrukken, indien ze amylase tot expressie brengen (= acinaire cellen). De andere cellen zullen beide reporter-eiwitten uitdrukken. Op deze manier kunnen we, na insuline immunocytochemische kleuring, betacellen opsporen die afkomstig zijn van acinaire cellen. Deze drukken insuline uit en EGFP, maar geen RFP. Indien ze niet afkomstig zijn van acinaire cellen of indien ze het enkel het reporterconstruct en niet het promoterconstruct bevatten, zullen ze insuline en EGFP uitdrukken, maar ook RFP.

In het kader van mijn stage voor de licentiaatsthesis heb ik reeds de volgende resultaten behaald: de twee constructen werden gekloneerd (pAmy-Cre en Rosa26-Lox-RFP-Lox-Ires-NLS-EGFP). (Ires staat voor internal ribosomal entry site. Het zorgt ervoor dat de ribosomen de translatie kunnen initi?ren vanaf een tweede site binnen een polycistronisch transcript. Het is een cis-acting RNA sequentie die de binding van het 40S ribosomale subunit mogelijk maakt op eukaryote en virale mRNA's stroomopwaarts van een translatie initiatie codon.) Momenteel worden de twee constructen in virale vectoren gebracht. Met lentivirale vectoren bekomen we een transductie-efficiëntie in acinaire cellen van ongeveer 20%. Met adenovirale vectoren gaat dit tot 80%, maar is er een minder goede overleving van de cellen. De stabiliteit van beide vectoren moet nog worden nagekeken over een periode van ongeveer 8 dagen (de duur van het experiment). Wanneer de beste transductie-methode is bepaald (efficiëntie gecombineerd met overleving en stabiliteit van expressie), zal hiermee verder gewerkt worden in het EGF/LIF cultuurmodel. Insuline immunofluorescentie gecombineerd met het opsporen van de RFP en GFP fluorochromen zal de betacellen aanduiden die afgeleid zijn van acinaire cellen. In een latere fase zal dit eventueel ook op humane cellen kunnen worden uitgevoerd.



Diabetes mellitus (type 1) is een metabole ziekte gekarakteriseerd door een tekort aan insuline-producerende betacellen. Eilandtransplantatie kan de functionele betacelmassa in diabetespatiënten herstellen maar er is een tekort aan donormateriaal. Als de transdifferentiatie van acinaire cellen naar betacellen met deze traceringsmethoden kan bevestigd worden, zal men gedifferentieerd exocrien weefsel kunnen beschouwen als een rijke bron om betacellen te genereren voor klinische toepassingen in de behandeling van diabetes mellitus.





(1) Bouwens L, Rooman I. Regulation of beta cell mass. Physiological Reviews (2005); 85(4): 1255-1270.

(2) Lardon J, Bouwens L. Metaplasia in the pancreas. Differentiation (2005); 73: 278-286.

(3) Rooman I and Bouwens L. Combined gastrin and Epidermal Growth Factor treatment induces islet regeneration and restores normoglycemia in C57Bl6-J mice treated with alloxan. Diabetologia (2004); 47: 259-265.

(4) Herrera PL, Nepote V, Delacour A. Pancreatic cell lineage analyses in mice. Endocrine (2002); 19(3): 267-278.

(5) Feil R, Brocard J, Mascrez B, LeMeur M, Metzger D, Chambon P. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc Natl Acad Sci USA (1996); 93(20): 10887-10890.

(6) Baeyens L, De Breuck S, Lardon J, Mfopou JK, Rooman I and Bouwens L. In vitro generation of insulin-producing beta cells from adult exocrine pancreatic cells. Diabetologia (2005); 48(1): 49-57.







AcroniemFWOTM391
StatusGeëindigd
Effectieve start/einddatum1/10/0630/09/10

Flemish discipline codes

  • Basic sciences