De efficiëntie van MACS en FACS voor de decontaminatie van testiculaire celsuspensies van kankerpatiëntjes

Introductie
Momenteel wordt veel onderzoek verricht naar vruchtbaarheidspreservatie bij prepubertaire kankerpatiëntjes. Een mogelijke oplossing is cryopreservatie van prepubertair testiculair weefsel vóór de start van de kankerbehandeling en de autologe transplantatie van testiculaire stamcellen na genezing. Een groot probleem voor de klinische toepassing van deze techniek is de mogelijke contaminatie van testisweefsel met tumorcellen in geval van leukemie of tumoren die metastasen vormen via de bloedbaan. Transplantatie van deze cellen zou een maligne relaps kunnen veroorzaken, wat ten stelligste moet vermeden worden. In deze studie werd getracht om muriene en humane testiculaire celsuspensies, besmet met tumorcellen, te decontamineren door middel van magnetische en fluorescentie geactiveerde cel sortering (respectievelijk MACS en FACS). Bovendien werd getracht de muriene celsuspensies aan te rijken aan spermatogoniale stamcellen om de efficiëntie van de intratesticulaire stamceltransplantatie te verhogen.

Materiaal en Methoden
Muriene testiculaire cellen werden gecontamineerd met 5% EL-4 cellen (muriene T-lymfoma cellen). Verse en ingevroren/gedooide suspensies werden gesorteerd door middel van MACS (CD49f+) en FACS (CD49f+, H-2Kb-). CD49f of alfa 6-integrine wordt onder andere door spermatogoniale stamcellen uitgedrukt en cellen van de spermatogene reeks brengen geen MHC-I moleculen tot expressie. Na elke stap werden de suspensies geëvalueerd via FACS-analyse en celcultuur en de uiteindelijk gesorteerde fracties werden getransplanteerd in steriele W/Wv-muizen. Een gelijkaardige experimentele opzet werd gebruikt in de humane experimenten waar testiculaire cellen werden gecontamineerd met 5% of 0.05% SB-cellen (humane B-cel acute lymfoblastische leukemiecellen). De gecryopreserveerde suspensies werden gesorteerd door middel van FACS (HLA-type1-). De gesorteerde fracties werden geëvalueerd via FACS-analyse, celcultuur en PCR voor de B-cel receptor.

Resultaten
Hoewel er na sortering van de muriene suspensies een duidelijke aanrijking aan CD49f positieve cellen werd waargenomen (van 3,94% vóór, naar 76,54% ná sortering), resulteerde dit slechts bij 4 van de 20 getransplanteerde testes in spermatogenese. De percentages H-2Kb positieve cellen namen duidelijk af (van 10,35% naar 0,41%), maar in celcultuur werd na volledige sortering nog in 1 well tumorgroei waargenomen en 1 van de 20 getransplanteerde muizen ontwikkelde een abdominale tumor.
Hoewel het percentage HLA-type 1 positieve cellen zeer laag was ( 0,79% en 0,40% bij de patiënten met respectievelijk 5% en 0,05% SB cellen) na sortering van de humane suspensies, werden er toch bij iedere patiënt tumorcellen teruggevonden, zowel via celcultuur als via PCR. Slechts bij 1 patiënt, waarvan de testiculaire celsuspensies gecontamineerd werden met 0,05% SB cellen, werden geen sporen van tumorcellen meer teruggevonden na sortering.

Conclusies
MACS en FACS zijn niet sensitief genoeg om testiculaire celsuspensies te decontamineren. Er moet dus verder gezocht worden naar andere alternatieven voor decontaminatie om maligne relaps ten gevolge van intratesticulaire transplantatie in patiënten te vermijden. De uiterst sensitieve PCR-techniek zou echter wel kunnen toegepast worden voor de detectie van mogelijke tumorcel contaminatie vóór cryopreservatie van het weefsel. Indien het weefsel niet gecontamineerd is, zouden de testiculaire cellen kunnen getransplanteerd worden zonder voorgaande sorteringen, wat een klinische toepassing veel gemakkelijker zou kunnen maken.