Biophysical characterisation of the transcription regulator PaaR2 from Escherichia coli O157.

Scriptie/Masterproef: Master's Thesis

Samenvatting

Toxine-antitoxine (TA) systemen spelen een belangrijke rol in de aanvang van bacteriële persistentie. Deze TA operons coderen voor een toxine dat in staat is om celgroei te inhiberen en een antitoxine die toxine activiteit neutraliseert. Het antitoxine bezit meestal ook een DNA-bindend domein waardoor het in staat is om de expressie van het operon te auto-reguleren. Er bestaan echter ook andere genetische organisaties, waaronder drie-component TA systemen. Het DNA-bindend domein ontbreekt in de antitoxines van deze systemen en de regulatie wordt hier uitgevoerd door een apart regulator proteïne. Het paaR2-paaA2-parE2 operon van Escherichia coli O157:H7 is zo een drie-component TA systeem.
Verschillende biofysische technieken werden gebruikt om de secundaire structuur van PaaR2 te bepalen. De resultaten indiceren dat PaaR2 een -helicale vouwing bezit en stabiel blijft na vriezen en ontdooien. Een potentiële “coiled coil” werd voorspeld aan de C-terminus, welke mogelijk een rol speelt in de oligomerisatie tot dimeren of octameren. De vorming van PaaR2 octameren is concentratie-afhankelijk en wordt dominant bij concentraties in de lagere micromolaire range. Een enkele Nanobody (Nb33) die op de octameer bindt met hoge affiniteit en 1:1 stoichiometrie werd geïdentificeerd. Deze Nanobody werd verder succesvol gebruikt om kristallen van de PaaR2 octameer te bekomen.
Het werd reeds aangetoond dat PaaR2 de transcriptie van het eigen operon onderdrukt door te binden aan de promotor/operator regio op vier voorgestelde primaire binding sites, gekarakteriseerd door de sequentie 5’-GTTTAGTG-3’. Bijkomend werden ook twee secundaire binding sites voorspeld die downstream gelegen zijn van het operon. De interacties met de volledige promotor/operator regio en de individuele binding sites werden zowel kwalitatief als kwantitatief geanalyseerd. De verschillende sequentie varianten in de vier primaire binding sites en de twee secundaire sites vertonen variërende affiniteiten en het bindingsmodel blijkt complexer dan een simpele 1:1 bimoleculaire interactie. Verder werd ook getest of het DNA rond PaaR2 wikkelt. Hoewel de resultaten van dit experiment niet volledig uitsluitend zijn, hinten ze wel dat PaaR2 in staat is om meerdere DNA-segmenten te linken. Deze hypothese werd verder getest met AFM. Er zijn echter nog meer uitgebreide experimenten nodig om te bepalen of de PaaR2 octameer in staat is om tegelijkertijd op de primaire en secundaire binding sites te binden en daarbij een lus in het intermediaire DNA induceert.
Datum prijsjun 2017
Originele taalEnglish
BegeleiderPieter De Bruyn (Advisor), Remy Loris (Promotor), Daniel Charlier (Co-promotor), Eveline Peeters (Jury) & Jan Steyaert (Jury)

Citeer dit

'