Genetische tracering van pancreatische transdifferentiatie

Samenvatting

Diabetes mellitus is de meest voorkomende metabole ziekte bij de mens. Ondanks de exogene insuline toediening hebben diabetes patiënten af te rekenen met tal van complicaties. Eilandtransplantatie kan de functionele beta-celmassa in diabetespatiënten herstellen maar er is een tekort aan donormateriaal. Dit kan opgelost worden door manieren te vinden om meer beta-cellen aan te maken van het beschikbare weefsel. In onze onderzoeksgroep heeft men gevonden dat acinaire exocriene rat pancreascellen in vitro transdifferentiëren tot endocriene beta-cellen. Gedurende dit proces verliezen de acinaire cellen hun differentiatiemerkers vooraleer de endocriene merkers verschijnen. Hierdoor is het zeer moeilijk om overgangscellen aan te tonen die nog fenotypische merkers van acinaire cellen bezitten en reeds merkers van de endocriene beta-cel uitdrukken. Deze studie heeft als doel het ontwikkelen van een genetische traceringsmethode om de exocriene-endocriene transdifferentiatie op een ondubbelzinnige manier aan te tonen. Hierbij vertrekken we van twee verschillende traceringsmodellen.

Het eerste traceringsmodel maakt gebruik van lenti-Pelastase-EGFP. Uit PCR-analyse is gebleken dat de elastase promoter lang actief blijft in de acinaire cellen tijdens de transdifferentiatie. Hieruit groeit onze hypothese dat lenti-Pelastase-EGFP als een traceringsvector kan worden gebruikt. De rat exocriene fractie wordt onmiddellijk na isolatie getransduceerd met de vector waarbij alleen getransduceerde cellen die elastase uitdrukken, EGFP positief zullen zijn. De cellen worden dan onder condities gebracht die de exocriene-endocriene transdifferentiatie induceren. De eventuele aanwezigheid van EGFP+, insuline+ cellen op dag 8 is een bewijs dat de acinaire cellen (EGFP+) een beta-cel fenotype (insuline+) verkregen hebben. Vooraleer deze transductie uit te voeren, hebben we eerst de multipliciteit van infectie (MOI) geoptimaliseerd, d.i. de verhouding van de hoeveelheid virale vector op het aantal cellen. Hieruit bleek dat we acinaire cellen succesvol kunnen transduceren met lentivirale vectoren. We kunnen een hoge transductie-efficiëntie bereiken (tot 87,9 +- 2,4%) bij gebruik van een hoge MOI. Bij transductie van de rat exocriene fractie met lenti-Pelastase-EGFP zien we dat EGFP aanwezig blijft tot op dag 8 in cultuur. Maar na fixatie en immunocytochemische kleuring voor insuline konden we het EGFP door directe fluorescentie niet meer detecteren. Bij de visualisatie van het EGFP met een polyclonaal anti-GFP zien we een aspecifieke kleuring. We hebben het EGFP tot nu toe niet samen kunnen visualiseren met insuline maar zullen in de nabije toekomst andere antilichamen tegen GFP uitproberen om dit probleem op te lossen.

Als alternatief voor het bovenstaande model werd een tweede traceringsmodel gegenereerd op basis van een Cre/Lox systeem. Hierbij zullen de cellen getransduceerd worden met twee constructen namelijk Pamy-Cre-Ires-ECFP en R26-Lox-Red-Lox-Ires-Nuc-EGFP. Deze constructen worden eerst gekloneerd en moeten dan in lenti- of adenovirale vectoren gebracht worden. Rat exocriene fractie zal onmiddellijk na isolatie getransduceerd worden met beide vectoren. De amylase promoter zal enkel in acinaire cellen Cre en ECFP produceren terwijl alle andere getransduceerde cellen positief zullen zijn voor Red en EGFP. In acinaire cellen zal Cre de sequentie tussen de Lox-sites (Red) wegknippen waardoor de acinaire cellen ECFP+, EGFP+, Red- zullen zijn . Niet-acinaire cellen (amylase-negatief) zullen ECFP en Cre niet tot expressie brengen. Hierdoor zijn deze cellen ECFP-, EGFP+, Red+. Bij de tracering zal de aanwezigheid van EFGP+, Red-, insuline+ cellen wijzen op de exocriene-endocriene transdifferentiatie. Tijdens het kloneren van de twee constructen ondervonden we heel wat technische problemen. We zijn er in geslaagd het volgende plasmide te kloneren pBS6-R26-Lox-Red2-Lox-Ires2-Nuc-EGFP-intronbetaglobine-polyAbetaglobine waarvan we de functionaliteit aangetoond hebben. We zijn er tot nu toe niet in geslaagd het plasmide Pamy-Cre-Ires-ECFP te kloneren. In de toekomst zullen deze kloneringen voltooid worden en zullen de twee constructen in adeno- en/of lentivirale vectoren worden gebracht.

Datum prijs	28 jun. 2005
Originele taal	Dutch
Begeleider	Luc Bouwens (Promotor) & Harry Heimberg (Co-promotor)