Isolatie en karakterisering van kameel antilichaam fragmenten tegen het prostaat specifiek antigen

Scriptie/Masterproef: Master's Thesis

Samenvatting

Een kameel werd verschillende malen geïmmuniseerd met een half-gezuiverd PSA mengsel. Uit het serum van de geïmmuniseerde kameel werd via differentiële adsorptie op protA en protG kolom de verschillende IgG subklassen gezuiverd. Een PSA specifiek immuunantwoord werd vastgesteld voor zowel de conventionele (IgG1) als zware keten antilichamen (IgG2 en 3) in solid fase ELISA en ook voor zowel vrij als gecomplexeerd PSA in Western blot. De immunisatie van de kameel met half-gezuiverd PSA mengsel is geslaagd, zodat het mogelijk moet zijn om PSA specifieke kameel antilichaam fragmenten af te zonderen.
Bloed werd afgetapt en de periferale bloedlymfocyten werden via een evenwichtscentrifugatie geïsoleerd. Uit de lymfocyten werd mRNA afgezonderd. Het cDNA werd bereid vanaf dit mRNA. Via een eerste PCR reactie met de primers Call001 en Call002 kon men al de mogelijke VH genfragmenten amplifiëren. Door middel van een geneste PCR met primers die specifiek de VHH genfragmenten herkennen, werden unieke restrictie enzym sites toegevoegd aan de VHH genfragmenten. Door restrictie en extensieve zuivering van zowel fragment als fagmide vector werd, na ligatie en transformatie in TG1 E. coli, een bibliotheek van 6x106 individuele transformanten verkregen. De kwaliteit werd getest en men kwam op een percentage juiste insert van 75. Met een in vitro selectie techniek, meerbepaald panning, werden verschillende positieve signalen verkregen in periplasmatisch extract. Uit fingerprinting analyse met het restrictie enzym HinfI werden 4 verschillende kameel antilichaam fragmenten geïdentificeerd. Door DNA sequentie onderzoek werd dit bevestigd. Al de geïdentificeerde kameel antilichaam fragmenten bezitten de specifieke VHH aminozuur substituties in hun FR2.
Om tot karakterisering over te gaan van de kameel antilichaam fragmenten, werden ze eerst in een productie vector geherkloneerd om ze dan in bulk te produceren. Voor elk werd hierdoor een goede opbrengst verkregen en de zuivering werd gedaan via IMAC. Op SDS-PAGE werd de zuiverheid van de geproduceerde kameel antilichaam fragmenten getest en men zag eveneens dat de experimenteel bepaalde moleculaire gewichten overeenkwamen met de theoretisch bepaalde moleculaire gewichten. Elk kameel antilichaam fragment is degelijk gezuiverd geweest, enkel werd vastgesteld dat het cAbPSA11 in een dimere vorm kon voorkomen. Al de rest van de geproduceerde kameel antilichaam fragmenten gaven het juiste patroon op SDS-PAGE.
Vervolgens werd een solid fase ELISA experiment gedaan om de respons van de geïdentificeerde kameel antilichaam fragmenten tegen het PSA rechtstreeks gecoat of gebonden op PSA specifiek monoklonaal antilichaam na te gaan. Het cAbPSA11 herkent enkel het PSA gebonden op PSA specifiek monoklonaal antilichaam. De cAbPSA15 en 20 herkennen enkel de PSA rechtstreeks gecoat op microtiter plaat. Het verschil tussen deze PSA specifieke kameel antilichaam fragmenten is doordat bij het coaten van PSA rechtstreeks op microtiter plaat, de conformatie van PSA drastisch veranderd en dus een invloed heeft op de epitoop herkenning van zowel monoklonaal antilichaam als kameel antilichaam fragment. Om een idee van de grote orde te krijgen waarin de affiniteit zich bevindt, werd een competitieve ELISA gedaan volgens Friguet. Hierbij werd een waarde van 50 en 60 nM gevonden voor respectievelijk cAbPSA11 en 15. Het cAbPSA11 herkent evenwel het volledig gezuiverde PSA beter dan het half-gezuiverde PSA mengsel. Voor cAbPSA15 werd echter vastgesteld dat
Datum prijs2001
Originele taalEnglish
BegeleiderSerge Muyldermans (Promotor)

Citeer dit

'