Transcriptionele regulatie van het argO-gen coderend voor een arginine-exportproteïne bij Escherichia coli

Samenvatting

In deze thesis wordt de transcriptieregulatie van het argO gen, coderend voor een arginine transporter bestudeerd. Binding van de transcriptieregulator ArgP op het argO operatorgebied wordt in vitro bestudeerd door middel van EMSA's. Transcriptionele activiteit wordt in vivo nagegaan in verschillende genetische contexten en milieus voor zowel ArgP als Lrp. DNA vervormingen bij binding van de regulators op het operatorgebied worden bestudeerd in aan- en afwezigheid van cofactors.
De thesis bestaat uit drie luiken. In een eerste luik wordt de bindingsregio van ArgP op de argO operator regio bepaald door middel van een Cu-OP footprint protectie-experiment. Twee zones van bescherming worden gevonden, een zone van -74 tot -54 en een zone -42 tot -28. Deze twee zones, de RBS en de ABS, zijn typische bindingsregios voor leden van de LTTR familie. Vervolgens wordt het belang van basenspecifieke contacten voor de binding achterhaald met een premodificatie-interferentie experiment (missing contact) en dit voor zowel de onderste als de bovenste streng. Hieruit blijkt dat de basen die cruciaal zijn voor binding van het proteïne aan de argO operator regio, zich vooral in en gedeeltelijk naast de twee zones van bescherming bevinden.
In een tweede luik werden mutaties aangemaakt in de operatorregio voor basen die van belang blijken voor de binding. Hieruit kan in vitro bepaald worden of de ArgP binding nog doorgaat en kan vervolgens in vivo worden nagegaan met beta-galactosidase activiteitsmetingen of de transcriptie te lijden heeft onder deze mutaties. Dit wordt nagegaan op verschillende milieus en voor genetische contexten waar de proteïnen ArgP of Lrp (een transcriptieactivator van argO) afwezig zijn. Hieruit kan naast het belang van de transcriptieregulators, ook het belang van de cofactors van deze regulators worden achterhaald. Een substitutiemutant in de RBS bindingsregio verlaagde de stimulatie van transcriptie door de cofactor arginine en het inhiberende effect op de transcriptie door de cofactor lysine. Een deletiemutant meer stroomafwaarts in de RBS regio verminderde de Lrp gereguleerde stimulatie van transcriptie. Een substitutiemutant in basen gelegen tussen het -35 en het -10 promtorelement leidde tot een verlaagde binding van ArgP en een betere binding van Lrp. Deze betere binding van Lrp is te wijten aan de competitie tussen ArgP en Lrp voor binding aan de argO operator, aangezien ArgP minder goed bindt, heeft Lrp een competitief voordeel.
In een laatste luik worden de vervormingen van de argO operator bij binding van ArgP bestudeerd. Bij circulaire permutatie-assays wordt de bindingsregio verschoven in de verschillende DNA fragmenten en de verschillende vervormingen die hiermee gepaard gaan kunnen bepaald worden door middel van de migratieafstanden van de fragmenten in de gel te meten. Deze vervormingen zijn courant in de familie van de LTTR, waartoe ArgP behoort. Ze zijn onderhevig aan cofactorbinding en spelen een belangrijke rol in de transcriptieregulatie. In afwezigheid van cofactor, leidt de binding van de ArgP dimeren op de RBS en ABS regio tot een plooiing van 48°, zowel de cofactor arginine als de cofactor lysine verminderen deze plooiing. Dit effect is meer uitgesproken voor arginine, waar de plooiing tot 30° verminderd wordt, lysine vermindert de plooiing tot 38°.

Datum prijs	3 jul. 2009
Originele taal	Dutch
Begeleider	Daniel Charlier (Promotor), Henri De Greve (Jury) & Geert Angenon (Jury)